Сюжет

40-летний Эцио Аудиторе да Фиренце поднялся на вершины иерархии ордена после окончания событий игры Assassin's Creed II. Отомстив убийцам отца и братьев, он покинул Рим и наслаждается жизнью на своей вилле. Действие игры начинается в 1499 году, когда Эцио после разговора с Минервой бежит из Рима вместе со своим дядей Марио Аудиторе. Затем тосканский город, где находилась вилла Аудиторе — Монтериджони (Monteriggioni) осаждена огромной армией Папской области, усиленной французскими отрядами. Осаду проводит сын Родриго — Чезаре Борджиа. Пушки Борджиа разрушают город, а Чезаре на глазах у Эцио убивает дядю Марио. Проведя уцелевших жителей Монтериджиони по катакомбам, Эцио решает отомстить Чезаре и отправляется в Рим. По дороге Эцио теряет сознание, так как во время боя ему прострелили плечо.

Действие игры переносится в 1500 год, где Эцио вынужден организовать и начать развивать «подполье» (в которое входят Римские воры, наемники, куртизанки, а далее и рекруты-ассасины), когда начинает возрождаться орден, лидером которого формально был Николло Макиавелли, который после передаёт титул Эцио. На протяжении игры Эцио пытается найти убийц своих родственников и отомстить им, а также вернуть Риму былой мир, порядок и процветание.

В будущем Дезмонд, Люси, Шон и Ребекка прибывают в Монтериджони. Они устраивают укрытие в Святилище под виллой Аудиторе, чтобы тамплиеры не смогли обнаружить их, и продолжают поиски Яблока Эдема, чтобы остановить надвигающуюся катастрофу.

Сам же Эцио при помощи Бартоломео, Ла Вольпе и Клаудии узнаёт что Яблоко Эдема было передано на изучение учёному, Катерина Сфорца будет в замке Сант-Анджело на следующей неделе, а Чезаре в замке с Папой. Кроме того, Ла Вольпе сообщает, что Макиавелли — предатель и даже показывает его встречу с солдатами Борджиа. Но, доверяя Макиавелли, Эцио просит Ла Вольпе не делать поспешных выводов. После Эцио проникает в замок и спасает Катерину, но не успевает добраться до Чезаре. Наконец, Эцио решает воссоздать Братство Ассасинов. Тем же вечером с Эцио встречается Леонардо Да Винчи, после чего Леонардо заново создает утерянное вооружение Эцио. Оказалось, что ученым, которому передали яблоко, был сам Леонардо, но Родриго забрал его. Да Винчи также сообщает обо всех планах и его постройках для армии Чезаре, которые Эцио придется уничтожить.

С помощью сенатора, посещающего бордель Марии, Эцио узнаёт, где находится кардинал Хуан Борджиа, он же Банкир. С его смертью Чезаре лишается средств на войну. Затем Эцио и Бартоломео проникают в лагерь французов и убивают барона Де Валуа. Наконец, Эцио спасает жизнь актёру Пьетро, который в тайне от Чезаре встречается с Лукрецией. Разузнавший Чезаре приказал Микилетто отравить его, Эцио нейтрализует Микилетто, но не убивает его и спасает актёра, а взамен получает ключ от запасного входа в замок Сант-Анджело. Тем же вечером Эцио встречает вора с повязкой на правом глазу, того самого который участвовал во время битвы за Монтериджони. Выясняется, что предатель — он, а не Макиавелли. Эцио убивает предателя и находит Ла Вольпе, который уже почти собирается убить Макиавелли, и сообщает о том, что узнал, предоставив письмо, которое он взял у вора.

Попав в замок, Эцио решает убить Чезаре, но тот, узнав, что Родриго хотел отравить его, убивает его и при помощи пыток узнаёт местоположение Яблока от Лукреции. Лукреция, желая отомстить Чезаре, рассказывает Эцио, где Яблоко. Эцио опережает Чезаре, и найдя Яблоко, решает раз и на всегда покончить с Чезаре. Сначала он уничтожает все войска Чезаре в Риме, затем расстраивает встречу Чезаре с кардиналами, чтобы он не попросил у них помощи. Наконец, через год Эцио навсегда избавляется от Чезаре, когда его арестовывают солдаты под обвинением в предательстве и убийстве.