Персонажа в оригинальной версии озвучивает Кевин Конрой, который уже давал свой голос герою в мультсериалах Анимационной вселенной DC. Актёр озвучения в российской версии — Юрий Брежнев)

Джокер  — антагонист и главный злодей. Самопровозглашённый Клоун — Принц преступного мира. Настоящее имя неизвестно. Разработал план по уничтожению заклятого врага — Бэтмена и захвату Готэма. Тайно финансировал проект «Титан», для создания непобедимой армии. Именно он устроил пожар в Блэкгэйте и заманил Бэтмена в лечебницу, и потом устроил бунт. Невероятно умен и жесток, его склонность к садизму и убийствам не подлежит классификации. Применяет токсин, который вызывает резкий смех и убивает жертву, растягивая рот в форме улыбки. Также использует оружие в виде клоунского реквизита, иногда применяет пистолет для решения проблем. В его аудиозаписях он обманывает доктора Янг, чтобы выпытать у неё информацию о проекте «Титан» и в конечном счёте ему удаётся. В конце игры вводит себе сыворотку, которая превращает его в огромного монстра.

Клоуна снова озвучил Марк Хэмилл,, подаривший злодею его знаменитый смех в мультсериалах «Бэтмен», «Новые приключения Бэтмена» и фильмам по их мотивам. Российским голосом маньяка стал — Константин Карасик)

Загадочник — один из противников Бэтмена, лично не появляется, слышен лишь его голос через радио. Постоянно оставляет для главного героя различные послания в виде загадок, ребусов и своих фирменных вопросительных знаков. Настоящее имя — Эдвард «Нигма» Нэштон. Одержим жаждой внимания и желает помериться знаниями с супергероями и полицейскими. Всегда оставляет послания-загадки насчёт следующих преступлений. Если собирать его аудиозаписи, то можно узнать, что он заранее знал о планах Джокера. По ходу игры сначала издевается над Бэтменом, позже начинает удивляться, а когда почти всё разгадано — поражён. Когда Бэтмен разгадал все головоломки Загадочника, он передаёт координаты его местонахождения полиции и того арестовывают.

Актёр озвучивавший злодея в оригинальной версии — Уолли Уинджерт, в русскоязычной — Михаил Тихонов)

Оракул — ещё один персонаж, который не появляется в игре, но постоянно даёт указания и помощь для главного героя. Настоящее имя — Барбара Гордон, бывшая Бэтгерл, помощница Бэтмена, дочь комиссара Гордона. Обладает эйдетической памятью и знанием компьютеров, превосходный хакер. Актриса озвучания — Кимберли Брукс. В российской версии — Елена Борзунова.

Джеймс Гордон — комиссар полиции, заключивший союз с Бэтменом против преступности и коррупции в Готэме. В ходе игры будет захвачен в плен Джокером и Харли Квин. Бывалый полицейский, опытный криминолог и отличный стрелок. Был отправлен Бэтменом обратно в Готэм, но как потом выяснилось, был перехвачен Джокером. Актёр озвучания — Том Кэйн, в российской версии — Денис Некрасов.

Харли Квинн — помощница Джокера, его бывший лечащий врач, которая влюбилась в своего пациента. Выполняет все указания Джокера, мешая Бэтмену идти по следам её хозяина. В ходе игры берет в заложники комиссара Гордона и надзирателя Куинси Шарпа. Настоящее имя — Харлин Квинзель. Превосходная гимнастка и психопатка, получающая удовольствие от насилия над другими людьми. Из её аудиозаписей можно узнать о том, как она «попала на удочку» Джокера.

Голосом психопатки выступила Арлин Соркин, которая уже озвучивала помощницу клоуна во время её первого появления, в мультсериале «Бэтмен», а также в его продолжениях. В российской версии её озвучивает Елена Чебатуркина.