• Американский футбоорк — враг дальнего и ближнего боя. Очень быстро передвигается, может метнуть мяч. Опасен, если догонит: отбрасывает назад. Кроме того, обычно нападает группами, к тому же имеет среднюю защиту.
• Флаер — летательное средство, вооружено плазменными орудиями. Слабо защищено, относительно медленно передвигается. Слабый воздушный враг.
• Гарпия — за исключением вида полный аналог гарпий из первого Сэма. Стреляет оранжевыми зарядами и пинается при приближении к врагу.
• Снеговик-ракетомётчик — секретный слабый враг.
• Очкастый кактус-пулемётчик — слабый враг дальнего боя.
• Разведдроид — шустрый летающий враг дальнего боя. Слаб.
• Труп с миниганом — слабозащищённый враг с миниганом. Необходимо как можно быстрее его уничтожить, он опасен. Одет в немецкую форму, при гибели говорит "Scheiße" (Шайзе) - в переводе с немецкого "дерьмо".
• Реактор-размножитель — ходячий металлический шар, обладающий хорошей защитой. Стреляет энергетическими шарами. Примечателен возможностью "создавать" подмогу. Уничтожать в первую очередь.

Боссы

• Квонго (первый босс) — огромная обезьяна, наподобие Кинг-Конга. Своим оружием Сэм будет уничтожать его очень долго, поэтому задача игрока — сдерживать натиск воинов Ментала и охранять катапульты, из которых союзники расстреляют Квонго. Может метнуть в Сэма камнем. По сценарию убитого Квонго поджаривают на гриле и съедают местные жители.
• Зум-Зум (второй босс) — огромная пчела. Лечится у гигантских ромашек  — их нужно уничтожить. Выпускает камикадзе — Зум-Зумов младших и атакует огненными шарами и стреляет жалами. Уничтожается из обычного оружия. По технике нападения и уничтожения фактически аналогичен гигантской личинке-экзотеху из Второго пришествия Крутого Сэма, но не такая живучая и опасная как вышеупомянутый монстр.
• Принц Чань (третий босс) — огромный (вернее, очень толстый) гуманоид. Обычное оружие его берёт слабо, поэтому первое время его нужно атаковать, стреляя по Священному Гонгу, затем он выйдет и прикончить его можно будет просто так (главное чтобы он вас не догнал). Оружие: сначала — песни, затем — отрыжка и (если догонит) вес.
• Клировский (четвёртый босс) — маг с планеты Клир. Средне защищён, но его лечит магический кристалл. Необходимо выстрелами раскрывать призмы и создать такую цепочку, чтобы падающий с неба на одну из призм луч света попал на кристалл. Проблема в том, что Клировский периодически закрывает одну из призм в цепи, которую вы успели раскрыть, и её нужно искать и открывать заново. После уничтожения кристалла особых проблем с Клировским не будет. Оружие: огненная магия.
• Сесил (пятый босс) — сентиментальный дракон розового цвета с длинными ресницами. Оружие: огненное дыхание. Обычное оружие Сэма его не берёт (за исключением снайперской винтовки и минигана, но они наносят очень незначительный урон). Нужно пользоваться бонусами высоких прыжков и собирать стрелы на скалах, а затем этими стрелами из турельных арбалетов стрелять в дракона. По сценарию Сесила не убивают, а он сам отдает Сэму медальон. Второй по силе, мощи и опасности босс в игре после мегаробота Хьюго.
• Хьюго (шестой босс) — В оригинале «Boss Hugo». Огромный робот, появляющийся из огромной коробки. Простым оружием Сэма его невозможно уничтожить. От него надо убегать до тех пор, пока не найдёте вертолёт и не сядете в него. До того если догонит — мгновенная гибель. После того, как вертолёт найден и захвачен, Хьюго взлетает и начинает летать вокруг, посылая ракеты, лазеры и просто тараня вертолёт. Ракеты с вертолёта могут нанести ему урон, однако одного боекомплекта на него не хватит и придётся садиться на одну из вертолётных площадок за боеприпасами (очень опасный момент). Это самый сильный и опасный босс в игре, несмотря на то, что он не финальный.
• Крепость Ментала (седьмой босс, финальный) — огромная пирамида на гусеницах (очевидно, что под эти самые гусеницы попадаться не стоит). Атаковать её можно, сев в антиграв, появившийся неподалёку. Пирамида неуязвима. На фронтовой стороне раздвигаются бронепластины и из крепости вылетают самолёты-камикадзе (очень быстро передвигаются, очень опасны, по возможности отстреливайте на подходе) и обнаруживается огромный кристалл внутри. Атакуя его, вы наносите крепости урон. Выпустив группу самолётов, крепость закрывается. После нескольких таких вылетов врата крепости открываются и больше не закрываются; от фазы уклонения и выживания можно перейти к фазе уклонения и атаки: крепость атакует вас огненными шарами, ядрами, ракетами, и другими предметами. Они очень опасны, их можно сбивать, но они многочисленны, и это не даст эффекта. От них нужно уклоняться и атаковать кристалл в крепости. Несмотря на внушительный вид, особых трудностей с уничтожением пирамиды не предвидится, если использовать появившийся неподалеку бонус Serious Damage. По сравнению с Угх-Заном 3 и Угх-Заном 4 (см. Serious Sam 3:BFE) данный босс не убедителен и относительно слаб.

Прочие объекты и нейтральные персонажи

• Транспортный корабль — летательный аппарат, предназначенный для перевозки и десантирования врагов. Имеет чрезвычайно крепкую броню. Уничтожить можно только двумя выстрелами из пушки.
• Гнаар — не враг; он часто мелькает в игровых роликах (часто — в качестве Сириусополисовского телеведущего), его можно встретить в самой игре, как правило, он связан с секретами
• Симбы — небольшие по росту гуманоиды синего цвета и с огромными ушами. Обитают на планете М’Дигбо.
• Зикси — также невысокие существа, отдалённо напоминающие людей. Имеют «человеческий» цвет кожи. Обитают на планете Магнор.
• Чи-Че — По росту и цвету кожи напоминают зикси, но уже более близкие к цивилизации. Носят традиционную китайскую одежду. Обитают на планете Чи-Фанг.
• Эльфисы — существа, наиболее близкие к людям по внешнему виду. Живут в обстановке Средневековья, но их одежда тянет, скорее, на восьмидесятые годы XX века. Живут на планете Эленьер. Даже Король чем-то похож на знаменитого певца Элвиса Пресли.

Саундтреки

Все музыкальные композиции в игре записаны штатным композитором Дамьяном Мравунацем. Вопреки расхожему мнению, группа Undercode не принимала участие в работе над саундтреком к Serious Sam II.