Известный уже русской публике, как талантливый писатель, он выступил теперь в качестве профессора, обладающего могучим и оригинальным талантом изложения и проводящего самостоятельные и новые воззрения на задачи и сущность истории. Эти воззрения находились в тесной связи с теми взглядами, какие выработались у него ещё в Харькове. Сам Костомаров так формулировал основную идею своих лекций:

Под влиянием этой идеи у Костомарова сложился особый взгляд на историю образования Русского государства, резко противоречивший тем воззрениям, какие высказывались славянофильской школой и С. М. Соловьёвым. Одинаково далёкий от мистического преклонения перед народом и от одностороннего увлечения идеей государственности, Костомаров старался не только вскрыть условия, приведшие к образованию русского государственного строя, но и определить ближе сам характер этого строя, его отношение к предшествовавшей ему жизни и его влияние на народные массы. Рассматриваемая с этой точки зрения, история Русского государства рисовалась в более мрачных красках, чем в изображениях её другими историками, тем более, что усвоенное Костомаровым критическое отношение к её источникам очень скоро привело его к мысли о необходимости признать недостоверными отдельные блестящие её эпизоды, считавшиеся до тех пор прочно установленными. Некоторые свои выводы Костомаров излагал и в печати, и они навлекали на него сильные нападки; но в университете его лекции пользовались неслыханным успехом, привлекая массу как студентов, так и посторонних слушателей.

В эту же пору Костомаров был избран членом археографической комиссии и предпринял издание актов по истории Украины XVII века. Подготавливая эти документы к изданию, он начал писать по ним ряд монографий, которые должны были в результате составить историю Украины со времени Хмельницкого; эту работу он продолжал до конца жизни. Кроме того, Костомаров принимал участие в некоторых журналах («Русское слово», «Современник»), печатая в них отрывки своих лекций и исторические статьи. В эту эпоху своей жизни Костомаров стоял довольно близко к прогрессивным кружкам петербургского университета и журналистики, но полному слиянию его с ними мешало их увлечение экономическими вопросами, тогда как он сохранял романтическое отношение к народности и украинофильские идеи. Наиболее близким для него журналом явился учреждённый собравшимися в Петербурге некоторыми из бывших членов Кирилло-мефодиевского общества «Основа», где он поместил ряд статей, посвященных по преимуществу выяснению существования двух русских народностей и полемике с отрицавшими такое значение польскими («Правда полякам о Руси») и великорусскими писателями. Как писал сам Николай Иванович:

Оказывается, что русская народность не едина; их две, а кто знает, может быть их откроется и более, и тем не менее оне — русския… Очень может быть, что я во многом ошибся, представляя такия понятия о различии двух русских народностей, составившияся из наблюдений над историей и настоящей их жизнию. Дело других будет обличить меня и исправить. Но разумея таким образом это различие, я думаю, что задачею вашей Основы будет: выразить в литературе то влияние, какое должны иметь на общее наше образование своеобразные признаки южнорусской народности. Это влияние должно не разрушать, а дополнять и умерять то коренное начало великорусское, которое ведет к сплочению, к слитию, к строгой государственной и общинной форме, поглощающей личность, и стремление к практической деятельности, впадающей в материальность, лишенную поэзии. Южнорусский элемент должен давать нашей общей жизни растворяющее, оживляющее, одухотворяющее начало. Южнорусское племя, в прошедшей истории, доказало неспособность свою к государственной жизни. Оно справедливо должно было уступить именно великорусскому, примкнуть к нему, когда задачею общей русской истории было составление государства. Но государственная жизнь сформировалась, развилась и окрепла. Теперь естественно, если народность с другим противоположным основанием и характером вступит в сферу самобытнаго развития и окажет воздействие на великорусскую.