По сравнению с предшествующей игрой, боевая система не претерпела серьёзных изменений. По словам разработчиков, динамика боя стала более активной и наступательной. Теперь поощряется быстрое наступление; контратаки стали менее эффективными. Система поведения неигровых персонажей стала агрессивной, игрока атакуют сразу несколько противников. Увеличилось количество оружия, появилась возможность использовать стационарные пушки в некоторых игровых ситуациях. Кроме того, серьёзно пересмотрена роль лошади, на которой теперь можно передвигаться и в пределах города. Лошадь участвует в некоторых элементах паркура.

В процессе выполнения заданий Эцио встречает и взаимодействует с различными историческими персонажами, такими как Леонардо да Винчи, Никколо Макиавелли, Катерина Сфорца; представители рода Борджиа являются основными противниками игры. Сюжет игры в целом чётко вписан в хронологические рамки.

Боевая система

Во время боя игрок может выполнять различные физические и психологические атаки, наносящие разный урон и дающие разные эффекты воздействия на противников.

Управление:

В агрессивном состоянии: нажатие клавиши головы позволяет подразнить противника, спровоцировав его атаку; нажатие клавиши руки с оружием позволяет провести силовую атаку, нажатие несколько раз подряд позволяет провести комбинацию; нажатие клавиши свободной руки позволяет захватить противника чтобы затем: атаковать головой, рукой без оружия или ногой, провести критическую атаку оружием или отпустить; нажатие клавиши ног позволяет ударить противника ногой в пах, уменьшив уровень защиты противника.

В защитном состоянии: нажатие клавиши головы позволяет подразнить противника, спровоцировав его атаку (облегчает разоружение); нажатие клавиши руки с оружием точно в момент удара противника позволяет провести контратаку (или обезоружить противника если игрок сражается врукопашную, оружие врага остаётся у игрока); нажатие клавиши свободной руки позволяет высвободиться из захвата противника; нажатие клавиши ног позволяет быстро увернуться от атаки противника.

Враги

• Обычные солдаты. Вооружены как правило одноручным оружием (мечи, булавы, молоты). Слабы, побеждают численностью. Атаки наносят относительно малый урон, легко блокируются. Солдата очень просто контратаковать или разоружить, защита пробивается после нескольких обычных силовых атак. После уничтожения нескольких солдат остальные могут разбежаться.

• Офицеры. Дополнительно обученные солдаты, вооружены преимущественно одноручным оружием (мечи, булавы, молоты). Легко контратакуются, но тяжело разоружаются. Высвобождаются из захвата Эцио через некоторое время. Могут атаковать с лошади, в этом случае для уничтожения противника приходится сначала сбивать врага с коня.

• Ловкачи. Лёгкие единицы, вооруженные короткими клинками (ножами, кинжалами). Часто уворачиваются от атак Эцио в бою, этот приём используется вместо блока. Легко контратакуются и обезоруживаются. Единственный противник, способный догнать убегающего игрока и ударить ножом по спине, при этом ассасин резко теряет скорость.

• Проныры. Единицы врага, вооружённые пиками или алебардами. Используя своё оружие, могут проверять стоги сена на наличие в них ассасинов, то есть могут найти укрывшегося в стоге сена игрока. Атаки наносят большой урон, пробивают любой блок, контратаковать можно только спаренными скрытыми клинками. Блокируют захваты, но легко обезоруживаются. Стоит отметить, что в руках Эцио отнятая у противника пика является не менее опасным оружием, способным также легко пробивать защиту врагов и наносить критические удары, однако при контратаке пика остаётся в противнике.