В 1506 году Чезаре сбежал из плена в Кастилии и в 1507 началась война в Виане. Пройдя поле битвы, Эцио побеждает Чезаре и сбрасывает с обрыва со словами: «Я передаю тебя в руки судьбы». После Эцио оставляет Яблоко Эдема под Колизеем в Риме.

В настоящем, из воспоминаний Эцио становится ясно, что тот спрятал Яблоко Эдема под Колизеем в Риме. Команда отправляется туда, чтобы забрать Яблоко, они проходят катакомбы, и находят искомое. Как только Дезмонд взял в руки Яблоко, оно овладело им и заставило ударить Люси скрытым клинком в область живота. Оба они падают без сознания. После, двое неизвестных находят героев и подключают Дезмонда к «Анимусу», так как тот был в состоянии сильнейшего шока, а спасти его можно было только так. В конце дополнения «The Da Vinci Disappearance» из разговора незнакомцев становится ясно, что одного из них зовут Уильям (вероятно, тот, с которым переписывалась Люси), а Дезмонд впал в кому.

Персонажи

Современные персонажи:

• Дезмонд Майлс — главный герой всей серии игры, ассасин, бывший бармен, потомок Эцио и Альтаира.
• Люси Стиллман — ассасин, обучает Дезмонда навыкам ассасина.
• Ребекка Крейн — инженер, построила и улучшила Анимус 2.0.
• Шон Гастингс — историк, наводит Дезмонду сведения о персонажах, неуклюжий и нервный циник.
• Уоррен Видик — учёный, тренер агентов Абстерго (появляется только в мультиплеере).

• Эцио Аудиторе да Фиренце — главный герой игры, мастер-ассасин и Великий Магистр итальянского Ордена Ассасинов, которым стал (по инициативе Макиавелли) за восстановление могущества и славы Ордена.
• Марио Аудиторе — дядя Эцио, мастер-ассасин, Великий Магистр итальянского Ордена Ассасинов. Убит Чезаре Борджиа.
• Клаудия Аудиторе — сестра Эцио, ассасин.
• Мария Аудиторе — мать Эцио.
• Кристина Веспуччи — возлюбленная Эцио, появляется в воспоминаниях Эцио о ней. Погибает в воспоминании «Бесплодные усилия любви».
• Ла Вольпе — друг Эцио, профессиональный вор, ассасин.
• Никколо Макиавелли — лучший друг и советник Эцио, мастер-ассасин и Великий Магистр итальянского Ордена Ассасинов после гибели Марио.
• Бартоломео д'Альвиано — друг Эцио, генерал армии Венеции, ассасин.
• Пантасилея Бальони — жена Бартоломео.
• Леонардо Да Винчи — друг Эцио, художник, изобретатель. Создал парашют для Эцио, а также вернул ему всё потерянное снаряжение.
• Катерина Сфорца — графиня Форли, любовница Эцио, просит у наёмников помощи в обороне Форли.
• Октавиан де Валуа — барон, французский полководец. Противостоит ассасинам. Захватил в заложники Пантасилею Бальони, вследствие чего убит Эцио Аудиторе.
• Фабио Орсини — кондотьер римской армии, двоюродный брат Бартоломео д'Альвиано, ассасин.
• Микелетто Корелья — тамплиер, профессиональный убийца, «правая рука» Чезаре Борджиа.
• Пьетро Росси — актер, любовник Лукреции Борджиа. Был тяжело ранен вследствие заговора, организованного Микелетто Корелья и Чезаре Борджиа.
• Родриго Борджиа — папа римский, Великий Магистр итальянского Ордена Тамплиеров, убит Чезаре Борджиа.
• Чезаре Борджиа — сын Родриго Борджиа, капитан — генерал папской армии, Великий Магистр итальянского Ордена Тамплиеров (после смерти Родриго). Атаковал фамильную виллу Аудиторе, убил Марио Аудиторе, украл яблоко Эдема и захватил в плен Катерину Сфорца. На протяжении всей игры является главным антагонистом игры. Убит Эцио Аудиторе.
• Лукреция Борджиа — дочь Родриго, сводная сестра и, по совместительству, любовница Чезаре. В дополнении «Исчезновение Да Винчи» является герцогиней.
• Эгидио Троке — сенатор, брат Франческо Троке, после того как был спасён Эцио от людей Банкира стал новым мужем Марии Аудиторе.
• Франческо Троке — камергер и секретарь папы римского, брат Эгидио Троке. Задушен Микелето и брошен в реку Тибр по приказу Чезаре.
• Федерико Аудиторе — брат Эцио. Появляется в воспоминании о Кристине.
• Вьери Пацци — сын банкира и тамплиер. Появляется в воспоминании Эцио о Кристине.
• Салаи — ученик Леонардо Да Винчи.
• Эрколе Массимо — лидер секты герметистов, союзник тамплиеров.