Двумя главными антагонистами в игре являются полковник ГРУ Евгений Волгин (озвучен Уцуми и Нилом Россом), желающий свержения генерального секретаря ЦК КПСС Никиты Хрущёва, и Босс (озвучена Иноуэ и Лори Алан), бывшая наставница Снейка. В подразделение «Кобра», которое возглавляет Босс, входят:

• Энд (End), искусный снайпер, считающийся «отцом современной снайперской стрельбы». Появление персонажа удостоилось 15 места в списке «Топ-100 игровых моментов» по версии ресурса IGN.
• Феар (Fear), обладающий сверхчеловеческой гибкостью и ловкостью.
• Фьюри (Fury), бывший космонавт, вооружённый огнемётом и джетпаком.
• Пэйн (Pain), контролирующий шершней, используемых им для самозащиты и атаки противника.
• Сорроу (Sorrow), душа умершего медиума.

К остальным персонажам относятся:

• Николай Соколов (озвучен Наоки Тацутой и Брайаном Каммингсом), советский учёный в области ядерного оружия. Его освобождение является целью Снейка.
• Ева (озвучена Мисой Ватанабэ и Сузеттой Минет), агент КГБ, посланная помочь Снейку, который впоследствии влюбляется в неё.
• Оцелот (озвучен Ямадзаки и Джошем Китоном), командир элитного отряда ГРУ «Оцелот», подчинённый Волгина.

В сюжете встречаются и юмористические отсылки к ранним играм. Например, внешность майора Райкова является пародией на подвергшийся критике женоподобный внешний вид протагониста игры Metal Gear Solid 2: Sons of Liberty Райдена, а среди охранников тюрьмы встречается дед неумелого солдата Джонни Сасаки из предыдущих игр.

История

Действие игры разворачивается в августе 1964 года. В скандал вокруг постройки Советским Союзом гигантского танка «Шагоход», способного стрелять ядерными ракетами с любой местности, помимо США втянуты ещё несколько держав. Задача главного героя, получившего кодовое имя Нейкед Снейк, — восстановить баланс сил и предотвратить эскалацию конфликта, грозящего перерасти в Третью мировую войну. Главный герой отправляется на территорию Целиноярска, где содержится советский ученый Соколов.

Миссия «Добродетель»

Агент ЦРУ Нейкед Снейк послан в леса Целиноярска в СССР. По радио Снейку оказывают поддержку Майор Зеро, Пара-Медик и бывшая наставница Снейка Босс. Его задача — освободить учёного-ядерщика Соколова, который тайно занимается разработкой продвинутого ядерного танка «Шагоход». Снейк успешно справляется с заданием, однако Босс предаёт его и переходит на сторону полковника Волгина, взяв с собой две ядерные боеголовки типа Davy Crockett. Соколова берут в плен члены отряда «Кобра», Снейк получает тяжёлую рану в битве с Боссом, а Волгин со своими подразделениями уходит. Чтобы скрыть похищение учёного, полковник приводит в действие одну из ядерных боеголовок. В ответ на предостережения Оцелота он говорит, что в случае необходимости обвинит в случившемся Босс.

Операция «Пожиратель змей»

Советская сторона засекает военный самолёт США, прилетевший эвакуировать Снейка, и Советский Союз официально заявляет, что именно Соединённые Штаты ответственны за ядерную атаку. Две нации оказываются на грани ядерной войны. На тайных переговорах между Линдоном Джонсоном и Никитой Хрущёвым заключается соглашение о попытке США доказать свою непричастность и восстановить мир. Штаты соглашаются остановить предательскую группу Волгина, уничтожить похищенный «Шагоход» и устранить Босса, предавшую американскую сторону.